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              免疫熒光技術(shù)操作步驟
              更新時(shí)間:2011-06-01 點(diǎn)擊量:2330

               免疫熒光技術(shù)操作步驟 

               

              .  直接免疫熒光法測(cè)抗原 

               

              基本原理 

                      將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高,非特異性熒光染色少,相對(duì)使用標(biāo)記抗體用量偏大。 

              試劑與儀器 

                        磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/LpH7.4 

                        熒光標(biāo)記的抗體溶液:以 0.01mol/LpH7.4 的 PBS 進(jìn)行稀釋 

                        緩沖甘油:分析純無(wú)熒光的甘油 + pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 份配制 

                        搪瓷桶三只(內(nèi)有 0.01mol/LpH7.4 的 PBS 1500ml) 

                        有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|) 

                        熒光顯微鏡 

                        玻片架 

                        濾紙 

                        37℃溫箱等。 

              實(shí)驗(yàn)步驟 

              1.  滴加 0.01mol/LpH7.4 PBS于待檢標(biāo)本片上,10min后棄去,使標(biāo)本保持一定濕度。 

              2.  滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液,使其*覆蓋標(biāo)本,置于有蓋搪瓷盒內(nèi),保溫一

              30min  

              定時(shí)間(參考:30min)。 

              3.  取出玻片,置玻片架上,先用 0.01mol/LpH7.4 的 PBS 沖洗后,再按順序過(guò) 0.01mol/L

              pH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 3-5 min,不時(shí)振蕩。 

              4.  取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋。 

              5.  立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度,一般可用“+”表示: 

              -)無(wú)熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見(jiàn);(++)熒光明亮;(+++ 

              --++++)熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上,而各種對(duì)照顯示為(±)

              或(-),即可判定為陽(yáng)性。

               

              注意事項(xiàng)

              1.  對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋?zhuān)WC抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋在 120-100 

              間,要自行摸索*梯度,建立的稀釋比例,抗體濃度過(guò)低,會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱,

              影響結(jié)果的觀察。 

              2.  染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,染色時(shí)間可以從 10 min 到數(shù)

              小時(shí),一般 30 min 已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于 37℃可加強(qiáng)染色效果,

              但對(duì)不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用 0-2℃的低溫,延長(zhǎng)染色時(shí)間。低溫染

              色過(guò)夜較 3730 min 效果好的多。 

              3.  為了保證熒光染色的正確性,試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,以排除某些非特異性熒光染

              色的干擾。 

              1)標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照:標(biāo)本加 1-2 滴 0.01mol/LpH7.4 的 PBS。 

              2)特異性對(duì)照(抑制試驗(yàn)):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗

              體。 

                  如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光,  待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為特異性陽(yáng)性染色。 

              4.  一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò) 3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本在當(dāng)天觀察,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。

              .    間接免疫熒光法測(cè)抗原 

               

              基本原理 

              染色程序分為兩步,*步,用已知未標(biāo)記的抗體(待檢標(biāo)本)加到已知抗原(待檢標(biāo)本)

              標(biāo)本上,在濕盒中 37℃保溫 30min,使抗原抗體充分結(jié)合,然后洗滌,除去未結(jié)合的抗體。

              第二步,加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗 IgGIgM 抗體(通常為熒光標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗)。

              如果*步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng),標(biāo)記的熒光標(biāo)記的二抗就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)

              合,從而可鑒定被檢測(cè)抗原。 

              試劑與儀器 

                        磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/LpH7.4 

                        緩沖甘油:分析純無(wú)熒光的甘油 + pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 份配制。

                        熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體:以 0.01mol/LpH7.4 的 PBS 進(jìn)行稀釋  。 

                        搪瓷桶三只(內(nèi)有 0.01mol/LpH7.4 的 PBS 1500ml) 

                        有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|) 

                        熒光顯微鏡 

                        玻片架 

                        濾紙 

                        37℃溫箱等。 

              實(shí)驗(yàn)步驟 

              1.  滴加 0.01mol/LpH7.4 的 PBS 于未知抗原標(biāo)本片,10min 后棄去,使標(biāo)本片保持一定濕度。 

              2.  滴加以 0.01mol/LpH7.4 的 PBS 適當(dāng)稀釋抗體,覆蓋未知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫 30min。 

              3.  取出玻片,置于玻片架上,先用 0.01mol/LpH7.4 的 PBS 沖洗 1-2 次,然后按順序過(guò)0.01mol/LpH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 5min,不時(shí)振蕩  。 

              4.  取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記二

              抗 

              5.  將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫 30min。 

              6.  重復(fù)操作 3。 

              7.  取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。

              8.  熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結(jié)果判定同直接法。 

              注意事項(xiàng) 

              1.  熒光染色后一般在 1h 內(nèi)完成觀察,或于 4℃保存 4h,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)  ,會(huì)使熒光減弱。 

              2.  每次試驗(yàn)時(shí)  ,需設(shè)置以下兩種對(duì)照: 

                

              1) 陰性對(duì)照:陰性血清+熒光標(biāo)記物   (需有使用人員自行建立標(biāo)準(zhǔn)) 

              2) 熒光標(biāo)記物對(duì)照:PBS+熒光標(biāo)記物 

              如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光,  待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為

              特異性陽(yáng)性染色。  

              3.  未知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中,始終保持濕潤(rùn),避免干燥。 

              4.  所滴加的抗體或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在未知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體

              流失,從而造成非特異性熒光染色。 

               

                                

              Storage:  Store at –20 ºC for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. The 

              lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater 

              than a year when kept at -20ºC. When reconstituted in sterile pH 7.4 0.01M PBS or diluent 

              of antibody, the antibody is stable for at least six weeks at 2-4 ºC. 

               

              Important Note:  This product as supplied is intended for research use only, not for use in 

              human, therapeutic or diagnostic applications.     

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