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硝基咪唑類酶聯(lián)免疫試劑盒說明書

一、藥物概述及檢測原理

硝基咪唑類抗菌藥，主要用于治療和預(yù)防滴蟲、阿米巴原蟲及厭氧菌引起的感染。但由于本類藥物有致癌作用，很多國家禁止其用于畜、禽、水產(chǎn)等產(chǎn)品的養(yǎng)殖。我國規(guī)定禁止本類藥物作為動物的促生長劑。

本公司的硝基咪唑類酶聯(lián)免疫試劑盒使用zui新生物技術(shù)開發(fā)，具有方便、快速、靈敏等特點。

本試劑盒利用硝基咪唑類抗體與硝基咪唑類可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，先在酶標板上預(yù)包被抗原，再加入標準品（樣本）和硝基咪唑類抗體，樣本或標準品中的硝基咪唑類藥物與固定在酶標板上的抗原競爭硝基咪唑類抗體，再加入酶標記二抗反應(yīng)，后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標準品（樣本）中硝基咪唑類藥物的含量成反比。

二、試劑盒內(nèi)包含組分：

標準品工作液：0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb，1 mL/瓶。

96孔酶標板：1塊

硝基咪唑類抗體工作液：1瓶（6mL/瓶）

酶標Ⅱ抗工作液：1瓶（12 mL/瓶）

20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）

組織樣品處理液Ⅰ：1瓶（干粉，選配，如有需求請向廠家索取)

牛奶樣本處理液：1瓶（10ml/瓶，選配，如有需求請向廠家索取）

復溶工作液：1瓶（50 mL/瓶）

底物A液：1瓶（6 mL/瓶）

底物B液：1瓶（6 mL/瓶）

終止液：1瓶（6mL）

說明書

蓋板膜

自封袋

三、用戶需要自備的設(shè)備和試劑

儀器：

酶標儀（檢測波長450 nm、630 nm）

電子天平（精度：0.01 g）

離心機（3000 g及以上）

生化培養(yǎng)箱（可調(diào)4℃，25℃）

搖床

旋渦振蕩器

氮吹儀

微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）

計時器

試劑：（試劑均為分析純）

乙酸乙酯

正己烷

氫氧化鈉

濃鹽酸

四、試劑盒特異性

試劑盒與其他硝基咪唑類藥物的交叉反應(yīng)率：

v 甲硝唑…………………………………100%

v 羥基甲硝唑……………………………47%

v 羥甲基甲硝咪唑………………………53%

v 替硝唑…………………………………2%

v 地美硝唑………………………………800%

v 奧硝唑…………………………………5%

五、樣本檢測步驟

1. 1工作液準備

v 組織樣品處理液Ⅰ：將粉末藥品溶于200ml去離子水即得（如有需求請向廠家索取）。

v 組織樣品處理液Ⅱ：準確量取400 mL乙酸乙酯和100 mL正己烷，充分混勻后待用。

v 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

v 0.1M NaOH：稱取0.8 g NaOH，加入200 mL去離子水溶解。

v 1M HCL：量取1ml濃鹽酸，加入11mL去離子水溶解混勻。

2. 2樣品前處理

組織（雞肉、豬肉）（稀釋倍數(shù)：0.5）

Ø 精確稱取2 g均質(zhì)后的組織樣品于50 mL塑料離心管中；

Ø 加入2 mL組織樣品處理液Ⅰ（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）以使處理液Ⅰ與樣本充分接觸；

Ø 加入8 mL組織樣品處理液Ⅱ（見5.1），充分震搖（或渦動）3 min（注：若實驗室配置有搖床，可充分震搖1min后使用搖床300rpm 25℃震搖10分鐘）；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 取4 mL上清液于潔凈的玻璃離心管中；

Ø 使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入2 mL正己烷，再加入0.5 mL復溶工作液，強烈震搖1min（或渦動30 s）；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上，離心5 min；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

Ø 取50 μL下層液體進行分析。

蜂蜜（稀釋倍數(shù)：0.5）

Ø 稱取2.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml塑料離心管中；

Ø 加入2ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），強烈震搖使蜂蜜溶解；

Ø 加入4ml 乙酸乙酯,強烈震搖5min（或使用渦動儀渦動3min）使樣本與有機相充分接觸；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入0.5 mL復溶工作液，強烈震搖2min（或渦動1min）；

Ø 取50 μL下層液體進行分析。

原奶方法一（稀釋倍數(shù)：5）

Ø 將采樣好的原奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；

Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；

Ø 加入50μL 1M鹽酸（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；

v 使用離心機室溫4000 g以上離心10 min；

Ø 取上層清亮液體100μL加入另一干凈離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油），再加入400μL復溶工作液，強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；

Ø 取50 μL液體進行分析。

原奶方法二（稀釋倍數(shù)：1）

Ø 將采樣好的原奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；

Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出2ml樣本加入50ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；

Ø 加入100μL 牛奶樣本處理液，再加入6ml乙酸乙酯，強烈震搖5min （或使用渦動儀渦動1min）；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 取1.5 mL上清液于潔凈的玻璃離心管中；

Ø 使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入1 mL正己烷，再加入0.5 mL復溶工作液，強烈震搖1min（或渦動30 s）；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上，離心5 min；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

Ø 取50 μL下層液體進行分析。

生蛋方法一（稀釋倍數(shù)：1）

Ø 量取1ml全蛋樣本至50ml塑料離心管中；

Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），8ml 乙酸乙酯,強烈震搖5min（或使用渦動儀渦動3min）使樣本與有機相充分接觸；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 移取4ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入0.5 mL復溶工作液，1ml正己烷，強烈震搖2min（或渦動1min），離心機室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

Ø 取50 μL下層液體進行分析。

生蛋方法二（稀釋倍數(shù)：5）

Ø 取出1ml樣本加入2ml離心管中；

Ø 加入100μL 1M鹽酸（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；

Ø 使用離心機室溫4000 g以上離心10 min；

Ø 取上層清亮液體100μL加入另一干凈離心管中，再加入400μL復溶工作液，強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；

Ø 取50 μL液體進行分析。

熟蛋（稀釋倍數(shù)：2）

Ø 稱取1g熟蛋樣本至50ml塑料離心管中；

Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），8ml 乙酸乙酯,強烈震搖5min（或使用渦動儀渦動3min）使樣本與有機相充分接觸；

Ø 使用離心機室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入0.5 mL復溶工作液，1ml正己烷，強烈震搖2min（或渦動1min），離心機室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

Ø 取50 μL下層液體進行分析。

3. 3檢測

準備：將要使用的酶標板條插入酶標板架上，并記錄各標準品和樣品的位置，為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗（每個樣本/標準品點兩孔），未使用的酶標板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環(huán)境中以防變質(zhì)；

加樣：向?qū)?yīng)微孔中加入標準品工作液/樣品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL抗體工作液；

孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于4℃避光反應(yīng)60 min；

洗滌：取出酶標板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復洗滌3~4次后，將酶標板倒置于吸水紙上，用力拍干；

加酶：在每孔中加入100 μL酶標Ⅱ抗工作液（洗滌后的酶標板在加酶前不宜在室溫環(huán)境過長時間放置，以防微孔干燥導致實驗結(jié)果差異）；

孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)20min；

洗滌：按照前面敘述的方法再次洗滌酶標板；

顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內(nèi)使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質(zhì)失效）；

孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)15 min；

終止：在反應(yīng)后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍變黃表明終止成功。

讀數(shù)：終止后的酶標板應(yīng)在5 min內(nèi)用酶標儀讀數(shù)，建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標板吸光度值。

4計算結(jié)果

設(shè)各標準品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標準（濃度為0 ppb的標準品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100%為各標準品（或樣品）對應(yīng)的吸光度的百分比：

使用半對數(shù)系統(tǒng)代入標準品對應(yīng)的吸光度的百分比，與標準品濃度擬合出標準曲線。

將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中，即可得出樣品對應(yīng)的濃度，后乘以樣品相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中檢測物含量。

六、試劑盒參數(shù)

Ø 試劑盒靈敏度：0.1 ppb；

Ø 標準曲線范圍：0.1 ppb-8.1 ppb；

Ø 板內(nèi)變異系數(shù)：<5%；

Ø 板間變異系數(shù)：<15%；

Ø B0吸光度ZUI佳值：>0.8；

Ø 回收率：90%±30%

Ø 樣品低檢測限：

豬肉、雞肉…………………………………………約0.5 ppb

蜂蜜…………………………………………………約0.1 ppb

原奶方法一…………………………………………約1 ppb

原奶方法二…………………………………………約0.2ppb

生蛋方法一…………………………………………約0.5 ppb

生蛋方法二…………………………………………約1.5 ppb

熟蛋……………………………………v……………約1 ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

七、分析限制

本試劑盒為定量或半定量試劑盒，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結(jié)果為陽性，建議使用儀器方法開展確證實驗（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

八、試劑盒貯存條件及有效期

Ø 試劑盒貯存在2-8℃有效期為一年，切勿凍存。

Ø 未使用完的酶標板條須密封保存2-8℃的環(huán)境中。

九、注意事項

Ø 使用試劑盒前，請務(wù)必仔細閱讀說明書。

Ø 試劑盒使用前，需將盒內(nèi)各組份置于實驗臺上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。

Ø 試劑在使用前許搖勻，混合時應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡。

Ø 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染，檢測過程中所用槍頭不得重復使用。

Ø 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。

Ø 樣品處理完畢后請立即分析，否則可能影響檢測結(jié)果。

Ø 底物A液、底物B液均為無色透明液體，若在使用前已變成藍色，或混合后立即變藍，說明試劑已污染或變質(zhì)。

Ø 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應(yīng)時間差對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

Ø 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水沖洗。若不慎ru眼，請在*清洗后去醫(yī)院檢查。

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