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              豬圓環(huán)病毒Ⅱ型檢測試劑盒(實時熒光PCR法)說明書
              更新時間:2020-03-04 點擊量:2853

              豬圓環(huán)病毒Ⅱ型檢測試劑盒(實時熒光PCR法)說明書

               

              【產(chǎn)品名稱】

              通用名稱:豬圓環(huán)病毒II型檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

              英文名稱:Porcine Circovirus II Detection Kit (Real-Time PCR Method)

              【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

              【預(yù)期用途】

              豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)在分類學(xué)上屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,為已知的zui小的動物病毒之一。本試劑盒利用實時熒光PCR原理,定性檢測PCV II型,對PCV II型引起的豬的疫病的診斷和監(jiān)控具有重要指導(dǎo)意義。

              【檢驗原理】

              本試劑盒針對PCVII型基因組高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含PCVII型基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

              【主要組成成份】

              序號

              組成

              25T/盒

              50T/盒

              1

              豬圓環(huán)II PCR反應(yīng)液

               437.5 μL×1管

              875 μL×1管

              2

              豬圓環(huán)II混合酶液

                62.5 μL×1管

              125 μL×1管

              3

              豬圓環(huán)II陽性對照

                  40 μL×1管

               40 μL×1管

              4

              豬圓環(huán)II陰性對照

                  40 μL×1管

               40 μL×1管

              5

              說明書

              1份

              1份

              注:陰性對照為豬基因組DNA,陽性對照為豬圓環(huán)II型經(jīng)滅活處理的核酸提取物

              【儲存條件及有效期】避光-20以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個月。

              【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

              【樣本要求】

              1. 新鮮采集的咽拭子、鼻拭子和糞便標本,并使用滅菌生理鹽水懸浮。

              2. 標本收集后若不能立即檢測,可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應(yīng)凍存于-20℃~-80℃。

              3. 標本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。

              【檢驗方法】

              1. 試劑準備(試劑準備區(qū))

              (1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

              (2)核算當次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

              n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)

              單反液配制表(每頭份)

              PCR反應(yīng)液

              17.5 μL

              混合酶液(Taq酶+UNG酶)

               2.5 μL

              (3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

              (4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管和試劑盒中的DNA提取液轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20以下冰箱冷凍保存。

              2.樣本準備(樣本處理區(qū))

              公司病毒提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

              3.加樣

              在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5 μL、終體積25 μL/管,蓋好PCR反應(yīng)混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μL/管,蓋好PCR反應(yīng)混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

              4.PCR(PCR擴增區(qū))

              (1)取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

              (2)按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

               

               

               

               

              反應(yīng)體積

              25 μL

              通道選擇

              FAM通道采集PCV II 熒光信號

              PCR

              反應(yīng)

              條件

              步驟

              條件

              循環(huán)數(shù)

              UNG處理

              50:2分鐘(min)

              1

              預(yù)變性

              95:3分鐘(min)

              1

              預(yù)擴增

              95:5秒(s)

              5

              55:40秒(s)

              PCR擴增

              95:5秒(s)

              40

              55:40秒(s)

              (此階段結(jié)束時采集熒光信號)

              注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團選擇None。

              【參考值(參考范圍)】

              1.試劑盒有效性判定:

              (1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

              (2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

              2.標本結(jié)果判定:

              (1)陽性:標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

              (2)可疑:標本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測,如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

              (3)陰性:標本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

              【檢驗結(jié)果的解釋】

              通道及檢測結(jié)果

              標本檢測結(jié)果解釋

              FAM

              陰性(-)

              標本中未檢出豬圓環(huán)II型

              陽性(+)

              標本中檢測出豬圓環(huán)II型

              【檢驗方法的局限性】

              • 當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的zui低檢出*可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
              • 本試劑盒僅供標本初步篩查使用,對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應(yīng)進一步使用培養(yǎng)法進行確診。

              【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的zui低檢出限為102 Copies/mL,產(chǎn)品CV值≤5%。

              【注意事項】

              • 整個檢測過程應(yīng)嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作,各區(qū)實驗服、儀器、耗材應(yīng)獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
              • 每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。
              • 為保證試劑不受標本污染,必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應(yīng)液保存于試劑準備區(qū)。
              • 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時離心。
              • 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在DI一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),并單獨存放。
              • 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標記。
              • 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置;不同批號試劑不能混用。
              • ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。
              • 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進行無害化處理后方可丟棄。
              • 萊克多巴胺試(0.05ppb)常規(guī)說明書

              滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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