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              線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書(可見分光光度法)
              更新時間:2020-05-30 點擊量:1984

              貨號:YJ2319                              規(guī)格:25管/12樣

              線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書

              可見分光光度法

              正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

              測定意義

              線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中,由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,也可逆過程水解ATP。此外,復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

              測定原理

              復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,通過測定Pi增加速率來測定復(fù)合體Ⅴ活性。

              需自備的儀器和用品

              可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

              試劑的組成和配制

              試劑一:25mL×1瓶,-20℃保存;

              試劑二:25mL×1瓶,-20℃保存;

              試劑三:1 mL×1瓶,-20℃保存;試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;臨用前每支加入1.3mL 蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;

              試劑五:6mL×1瓶,4℃保存;

              試劑六:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入3mL蒸餾水,充分混勻;溶解后 4℃保存一周;

              試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

              試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

              試劑九:液體 10mL×1 瓶,室溫保存。

              定磷試劑的配制:按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1的比例配制,配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染(請根據(jù)需要,用多少配多少)。

              注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

              樣本的前處理:

              組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

              ① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細菌或細胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

              ② 將勻漿600g,4℃離心 5min。

              ③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。

              ④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ(此步可選做)。

              ⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入800uL試劑二和8uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測定。

               

               

               

              測定步驟

              • 酶促反應(yīng)

              試劑名稱(μL)

              對照管

              測定管

              試劑四

              50

              50

              試劑五

              200

              200

              樣本

               

              250

              混勻, 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴 30min

              試劑六

              100

              100

              樣本

              250

               

              混勻,4000g,25℃離心 10min,取上清液

              • 定磷

              上清液

              250

              250

              定磷試劑

              1250

              125

              混勻,室溫靜置10min左右,在660nm處讀 A測定管和A對照管,計算ΔA=A 測定管-A對照管。

              復(fù)合體Ⅴ活性計算

              標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y = 1.2487x + 0.0361;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),y為A值。

              1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計算:

              (1)按樣本蛋白濃度計算

              單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

              復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min /mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=64×(ΔA-0.0361) ÷Cpr

              此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

              (2)按樣本鮮重計算

              單位的定義:每 g 組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

              復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V反總×106]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T=51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

              (3)按細菌或細胞密度計算

              單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

              復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0361)÷1.2487×V反總×106]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×(ΔA-0.0361)

               

              V 反總:反應(yīng)體系總體積,6×10-4 L;V 樣:加入樣本體積,0.25 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應(yīng)時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500 萬。

               

              實驗代做服務(wù):

              ELISA試劑盒免費代檢測

              CCK8檢測

              基因組DNA提取

               

              蛋白相互作用分析

              Western Blot

              免疫組化

              熒光定量PCR

              動物模型服務(wù)

              流式細胞檢測

              ROS氧化分析

              激光共聚焦

              DNA甲基化實驗

              細胞劃痕

              鈣離子濃度檢測

              掃描電鏡實驗

              microRNA測序

              動物實驗

              探針合成

              ATP/ADP檢測

              石蠟/冰凍切片

              定點突變

              線粒體膜電位(MMP)檢測

              細胞生長曲線的測定

              藥理毒理動物實驗

               

              免疫共沉淀

              真核表達載體構(gòu)建

              染色質(zhì)免疫沉淀CHIP

              非標(biāo)定量(Label-free)實驗

              滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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