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              miRNA cDNA*鏈合成試劑盒說明書
              更新時間:2015-05-18 點擊量:1189

              miRNA cDNA*鏈合成試劑盒說明書

               

               

               

              miRNA cDNA Kit

              miRNA cDNA*鏈合成試劑盒

              目錄號:YJ2141

              保存條件:-20℃保存。

              組分說明

               

                           Cat. No.                              YJ2141

                           Kit Size                               25  次

                           1mM Tris,PH8.0                          1 ml

                           E. coli    Poly(A) Polymerase(5U/μl)   15 μl

                           10×Poly(A) Polymerase Buffer           80 μl

                           10mM ATP                               15 μl

                           25μM RT primer                         90 μl

                           5×RT Buffer                            120 μl

                           超純dNTPs(10mM each)                     30 μl

                           SuperRT Reverse Transcriptase          15 μl

                           RNase-Free Water                        1 ml

               

               

                          本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途  

               

               

              產(chǎn)品簡介

               

                本試劑盒采用在miRNA  3’末端加多聚A尾的方法來使miRNA具有Poly(A)尾,之后再使用Oligo(dT)-Universal  tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應,zui終合成miRNA對應

              的*鏈cDNA。

                miRNA cDNA*鏈合成試劑盒包含miRNA  3’末端Poly(A)尾修飾過程及修飾后逆

              轉(zhuǎn)錄過程需要的全部試劑。該試劑盒具有非常高的 Poly(A)修飾和逆轉(zhuǎn)錄效率,可以從

              1 ng-2 μg的total  RNA中有效獲得miRNA對應的cDNA*鏈。并且操作簡便、快捷,

              可以用于從一個反應合成的cDNA中同時檢測多種miRNA,不僅減少了誤差、節(jié)約了樣

              品,同時還實現(xiàn)了檢測的高通量。

               

               

              備注:本試劑盒須與miRNA熒光定量檢測試劑盒(YJ2142)配套使用。

               

               

              自備實驗材料:1 ng-2 μg的總 RNA,或0.1 ng-1 μg的小分子RNA。

               

               

              注意事項

               

              預防RNase污染,應注意以下幾方面:

              1.使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。

              2.玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時,塑料器皿可在0.5  M NaOH中浸泡

                 10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。

              3.配制溶液應使用無RNase的水。

              4.操作人員戴一次性口罩和手套,實驗過程中要勤換手套。

               

              操作步驟

               

              A.miRNA加Poly(A)尾的過程:

              1.首先根據(jù)所用RNA的量,按如下公式,用1 mM Tris(PH8.0)來稀釋10 mM ATP:

                                      ATP稀釋系數(shù)=5000/__ng的總RNA

                 例:如果總RNA的起始用量為100 ng,那么ATP稀釋系數(shù)=5000/100=50。即將ATP 

                 稀釋50倍(1 μl的10 mM ATP加49 μl的1 mM Tris,PH8.0)。

              2.向冰浴中預冷的無RNase反應管中加入以下試劑至總體積25 μl。

               

                          試劑                                    體積          終濃度

                          total RNA*                            X μl       可達2 μg

                          10×Poly(A) Polymerase Buffer          2.5 μl        1×

                          第“1"步中稀釋好的ATP                         1 μl          —

                          E. coli    Poly(A) Polymerase(5U/μl)  0.5 μl       2.5 U

                          RNase-Free Water                   up to 25 μl      —

                                    *反應中使用的total RNA必須含有小分子RNA。

                 此過程也可以直接使用小分子RNA(建議加入量為2-5  μl。請根據(jù)目的miRNA的豐

                 度來確定加入量)。

              3.輕輕混勻上述反應液,短暫離心將液體收集于管底。37℃,孵育15分鐘。此過程結(jié)

                 束后,立刻進行*鏈cDNA的合成,或于-20℃暫存。如需長期保存,建議存放于

                 -80℃。

              B.修飾后的miRNA cDNA*鏈合成的過程:

              1.向冰浴中預冷的無RNase反應管中加入下表中試劑,至終體積20 μl:

               

                                   試劑                               體積

                                   上述Poly(A)反應液                      4 μl

                                   超純dNTPs(10mM each)                1 μl

                                   25μM RT primer                    3 μl

                                   5×RT Buffer                       4 μl

                                   SuperRT Reverse Transcriptase    0.5 μl

                                   RNase-Free Water                 7.5 μl

               

              2.輕輕混勻上述反應液,短暫離心將液體收集于管底。42℃,孵育50分鐘。

              3.85℃,孵育5分鐘,終止反應。合成的  cDNA反應液可以直接進行熒光定量檢測實

                 驗,也可以于-20℃保存?zhèn)溆谩?/SPAN>

               

                  相關產(chǎn)品信息

               

                              目錄號             產(chǎn)品名稱

                              YJ0627          miRNA提取試劑盒

                              YJ2141          miRNA cDNA*鏈合成試劑盒

                              YJ2142          miRNA熒光定量  PCR檢測試劑盒

               

              滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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