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              產(chǎn)品目錄
              pUC-T TA快速連接試劑盒(含載體,連接酶)說明書
              更新時間:2020-12-23 點擊量:1051

                

               

              pUC-T TA快速連接試劑盒(含載體,連接酶)說明書

               

              pUC-T Quick Ligation Kit

              pUC-T TA快速連接試劑盒(含載體,連接酶)

               

              目錄號:YJ2591

               

               

              保存條件:-20℃保存。

               

              組分說明

               

                              Cat. No.                            YJ2591

                              Size                                  20次

                              pUC-T(50 ng/μl)                       20 μl

                              Conctrol Insert (50 ng/μl)            10 μl

                              Quick T4 DNA Ligase                   20 μl

                              2×Quick Ligation Reaction Buffer     120 μl

               

               

                            本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途  

               

               

              產(chǎn)品簡介

               

                pUC-T TA載體是一種克隆PCR產(chǎn)物的載體,它是由pUC18載體在EcoR V

              酶切位點處切開,在兩側(cè)的3′端添加T而成。由于大部分耐熱聚合酶反應(yīng)時都會在 PCR

              產(chǎn)物的3′端添加一個A,它可以與pUC-T 3′端的T互補連接,因此可大大提高PCR產(chǎn)物的連接和克隆效率。

               試劑盒中配備率的T4 DNA Ligase和為快速DNA連接優(yōu)化的2×Quick Ligation 

              Reaction Buffer。連接效率相當(dāng)于用T4 DNA Ligase 進(jìn)行常規(guī)連接1小時。帶有插入片

              段的重組子可根據(jù)α互補原理,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,判斷載體中有無外源基因的插入。克

              隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

               

              注意事項

               

              1.Insert DNA 要求

                 1)連接使用的PCR片段3’末端應(yīng)帶有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶,如我公司的  Pfu擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平滑末端,可使用加A試劑盒加上A尾后,再進(jìn)行T載體克隆。

                 2)PCR產(chǎn)物建議進(jìn)行切膠回收純化后再進(jìn)行T載體克隆,以免PCR產(chǎn)物中的非特異片

                 段或殘存引物等雜質(zhì)影響。推薦使用  YJ2302/YJ0524/YJ0518 快速瓊脂糖凝膠

                 DNA回收試劑盒。

              2.連接反應(yīng)要求

                 1)本試劑盒能使大多數(shù)連接反應(yīng)在25℃條件下5分鐘甚至更短時間內(nèi)達(dá)到反應(yīng)終點,

                 增加反應(yīng)時間反應(yīng)效率不會增強(qiáng)。如用快速連接反應(yīng)  1小時后,轉(zhuǎn)化效率會明顯降

                 低;如25℃快速連接反應(yīng)過夜,則轉(zhuǎn)化效率會下降到75%。

                 2)2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP,使用前置于冰上使其融化后充分混

                 勻,建議初次使用分裝成小管凍存,避免其反復(fù)凍融影響DNA連接效率。

                 3)由于T4 DNA Ligase中含有甘油,比較粘稠容易掛壁,建議使用之前短暫離心將

                 液體收集到管底,取樣時槍頭盡量不要深入液面太深,以免粘在槍頭上造成損失。

                 4)如快速連接產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn),因快速連接反應(yīng)體系中的PEG會影響電轉(zhuǎn)效率,建議

                 使用離心柱將連接產(chǎn)物進(jìn)行DNA純化(如YJ2301快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒)后再

                 進(jìn)行電轉(zhuǎn)。

              3.感受態(tài)細(xì)胞要求

                 建議使用的熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,這樣才可能得到比較理想的陽性克隆,如需  

                 進(jìn)行藍(lán)白篩選,宿主細(xì)胞必須具有正確的基因型(F′編碼的【lacZ ΔM15】)產(chǎn)生ω片

                 段,才能與載體DNA產(chǎn)生的LacZ  α多肽結(jié)合,表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶活性(α互補)。

                 pUC-T  TA載體以pUC18載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成,因此,適合pUC18載體的感受態(tài)細(xì)胞都可以使用。推薦使用本公司YJ0807 *0感受態(tài)細(xì)胞、YJ0808 DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

              4.陽性克隆篩選

                 陽性DNA-片段成功插入至pUC-T Vector中后,一般情況下β-半乳糖苷酶的表達(dá)將受

                 到破壞,重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時將顯示白 

                 色菌落。但有時比較短的DNA-片段插入載體時,基因的讀碼框有可能正好與LacZ的 

                 讀碼框相吻合,克隆體也會顯示藍(lán)色菌落。

              5.陽性對照

                 為了確認(rèn)實驗操作的正確性,以及實驗試劑的有效性,我們建議使用本試劑盒中配

                 備的Control Insert(750 bp)進(jìn)行陽性對照實驗。

               

              使用方法

               

              1.按以下體系配制反應(yīng)液:

               

              成分                               反應(yīng)體系          對照體系

              pUC-T                                 1 μl          1 μl

              DNA插入片段   *                    0.1 -0.3 pmol      --

              Control Insert DNA                       --           1 μl

              2×Quick Ligation Reaction  Buffer     5 μl          5 μl

              Quick T4 DNA Ligase                    1 μl          1 μl

              RNase-Free Water                      補足至 10 μl     補足至 10 μl

               

                   *Insert DNA的使用量:在進(jìn)行克隆時,Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為:1:2-1:10,

                   可根據(jù)實驗情況選擇適當(dāng)?shù)腣ector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比。Insert DNA的使用量=nmol數(shù)×660×Insert DNA bp數(shù)。本載體1 ml(50  ng)的摩爾數(shù)約為0.03 pmol。

               

              2.輕輕混合,短暫離心。25℃反應(yīng)5分鐘。

                 注意:反應(yīng)時間不要超過15分鐘,否則會降低連接效率。

              3.反應(yīng)結(jié)束后,將DNA連接產(chǎn)物存放于0-4℃,而后進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗;也可將  DNA連接

                 產(chǎn)物置于-20℃保存。

                 注意:勿進(jìn)行加熱失活反應(yīng)。

              4.將連接產(chǎn)物加入50 μl感受態(tài)細(xì)胞中(將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化),冰浴30分鐘。

                 注意:用化學(xué)法轉(zhuǎn)化時,連接產(chǎn)物的加入量不要超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。

              5.42℃熱擊45秒鐘,迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中,冰上靜置2-3分鐘。

              6.加入450 μl無菌SOC或LB培養(yǎng)基,混勻后置于37℃搖床,150 rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘,

                 使菌體復(fù)蘇。

              7.根據(jù)實驗要求,取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞,加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固體

                 培養(yǎng)基上,用無菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開,將平板置于37℃,直至液體被吸收后,

                 倒置培養(yǎng),37℃培養(yǎng)12-16小時。

              8.計算白、藍(lán)色菌落,挑選白色菌落,使用PCR法或酶切法鑒定插入片段是否正確。

               

                 

              實驗代做服務(wù):

              ELISA試劑盒免費代檢測

              CCK8檢測

              HE染色

              蛋白相互作用分析

              Western Blot

              免疫組化IHC染色

              熒光定量PCR

              動物模型服務(wù)

              流式細(xì)胞檢測

              免疫熒光染色

              激光共聚焦

              DNA甲基化實驗

              石蠟/冰凍切片

              透射電鏡服務(wù)

              掃描電鏡實驗

              蛋白雙向(2-D)

              動物實驗

              免疫共沉淀

              原位雜交(FIsh)

              蛋白質(zhì)純化

              分子克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建服務(wù)

              組蛋白甲基化磷酸化乙酰化

               

              蛋白雙向2D-WB

               

              藥理毒理動物實驗

               

              番紅O固綠染色

              明膠酶譜MMP

              酶活性檢測

              動物造模/模型實驗服務(wù)

                                                  

              滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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